capsule staining + negative staining

-       목적: 어떤 균 종의 세균은 세포벽의 외층이 capsule(원형의 점액질의 층)이나 slime layer(일정한 형태를 유지 하지 않고 불규칙적인 모양을 가진 점액질의 층)로 둘러싸여있으며 capsule은 일반 염색 시 균체 주위가 불투명하게 보이게 하고 명확히 구별되지 않는다. 이런 capsule을 특수 염색하여 관찰 할 수 있게 하게 이를 세균동정에 이용한다.

1) Capsule staining

-       Capsule(협막): 세포벽의 외층을 둘러 싸고 있는 gelatin성 물질로 세균의 종류나 배양배지의 조성에 따라 다르게 나타날 수 있지만 주로 수용성, 비이온성 polysaccharides나 polypeptide나 glycoprotein으로 구성되어 있으며 협막의 비온성 때문에 염색액이 유지되지 않는다. Capsule은 일반적으로 계대배양에서는 소실되기 쉽기 때문에 혈청이나 skim milk를 첨가한 배지에서 세균을 배양시키면 capsule 관찰이 쉽다. capsule이 존재하면 영양물질의 이용이 용이하지 못한 기간 동안 분해되어 저장 에너지원으로서 세포에 공급될 수 있다.

-       협막 형성 병원균: S. Pneumoniae, K. pneumonia, Cryptococcus neoformans, Haemophilus influenza, Yersinia pestis 등으로 capsule이 있으면 세균은 숙주의 방어 작용 및 백혈구의 탐식작용에 저항할 수 있기 때문에 보통 병원성이 강하다.

-       협막 염색법의 종류

①     Anthony’s method: 염색액으로는 crystal violet을 쓰고 매염제로는 20% 황산동 수용액을 쓰며 가온 염색하지 않는다. 황산동용액의 Cu는 중금속으로 capsule은 탈색시키지만 cell은 잘 통과하지 못해 cell은 crystal violet이 그대로 남아 있는다. 그래서 검경하면 균체는 dark blue color로 보이고 capsule은 faint violet color로 보인다.

②     Hiss’ method: Anthony’s method를 수정한 방법으로 도말, 건조, 고정하고 crystal violet 원액 5mL, 증류수 69~95mL의 혼액으로 수초 간 가볍게 가온 염색한 후 20% 황산동 수용액으로 씻고 그대로 건조하는 것이다. 검경하면 균체는 적자색, 협막은 엷은 적색으로 염색된다.

③     Rabiger's method: 주로 탄저균의 협막을 염색하는데 쓰는 염색법이다. 10% 겐티 아나자포르말린 수 약 20분 염색한 후 수세하고 검경하면 균체가 농자, 협막은 엷은 청색으로 염색된다.

2) Negative staining

-       관찰하고자 하는 구조물은 염색되지 않아 흰색으로 나오고 배경을 염색하여 균체의 형태를 신속히 관찰하기 위한 염색방법이다.

-       음성 염색하는 병원균: 나선균(Spirochaetes), Cryptococcus neofarmans의 농도 짙은 gelatin으로 된 capsule이 있는 병원균

-       염료: india ink, Congo red, nigrosin

-       원리: 매질 염색에 쓰이는 염료는 발색단이 음이온이기 때문에 일반적으로 음전하를 띠는 세균을 염색시키지 못하고 염료가 세포 주변에 집적된다. Spirochaetes 등과 같이 염기성 염료로 잘 염색되지 않는 세균은 황이나 poly-hydroxybutyrate 입자 및 포자 등과 같은 굴절성함유물이 존재유무의 판별에 쓰이기도 한다.

-       장점: negative staining은 다른 염색법과 달리 세균을 화학 약품이나 열처리 하지 않으므로 세균의 모양을 변화시키지 않고 관찰할 수 있는 장점이 있다.