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그람 염색(Gram staining)

1. 개요:
세균의 그람 염색성에 따른 분류를 위해 하는 염색법이며, differential stain이라고도 한다. 그람 염색성은 세포벽의 구성에 따라 구별되며 양성/음성이라고 해서 전기적 성질과 관련이 있는 것이 아니고 형태학적 차이에서 기인한다. 세균은 그람 양성균과 그람 음성균의 두 균으로 나눌 수 있다.  

2. 그람 양성균/ 그람 음성균

①     그람 양성균: 세포벽의 80~90&가 peptidoglycan으로 여러 층으로 두껍게 발달되어 있어 세포벽이 아주 단단하다. 그람 염색 결과 자주색(보라색)으로 염색된다.

②     그람 음성균: 양성균과 달리 peptidoglycan이 한 겹으로 얇아 세포벽의 10~20%만을 차지한다. 인지질, lipoprotein, LPS(lipopolysaccharide)등으로 이루어진 외막(outer membrane)이 존재한다. 그람 염색 결과 분홍색으로 염색된다.

3. 염색 과정과 원리:

①     크리스탈 바이올렛(gentian violet가능) 염색: 크리스탈 바이올렛으로 염색하면 그람 양성, 음성균 모두 자주색으로 염색된다.

②     착색 단계(매염): 크리스탈 바이올렛으로 염색된 세균에 요오드 용액을 처리하면 크리스탈 바이올렛과 요오드가 반응하여 세포 내에 불용성의 복합체(CV-1)를 형성한다. 여전히 그람 양성, 음성균 모두 자주색으로 보인다.

③     탈색: 착색된 세균에 알코올을 처리하면 CV-1 복합물이 용해된다. 이 때 그람 양성균은 알코올이 여러 층의 펩티도글리칸을 탈수시켜 분자간의 공간을 좁히기 때문에 CV-1 복합체가 세포 안에 그대로 남는다. 하지만 그람 음성균은 대부분 인지질로 구성된 외막과 세포막이 알코올에 의해 쉽게 용해되어 큰 구멍이 형성되고, 펩티도글리칸 층이 얇아 좁혀질 공간이 없어 CV-1이 세포 밖으로 빠져나가고 탈색된다. 따라서 탈색단계가 지나면 그람 양성균은 자주색 (그대로)이지만 그람 음성균은 백색으로 보인다.

④     대조염색: safranin O(basci fuchusin가능)으로 대비 염색을 하면 백색으로 탈색되었던 그람 음성균은 탈색되었기 떄문에 safranin의 색인 분홍색으로 염색이 되지만 그람 양성균은 탈색되지 않기 때문에 자주색(크리스탈 바이올렛으로 염색했던 그 색)으로 남아 있게 된다.

4. 그람 양성이 음성으로 보이는 경우의 원인

①     화염 고정시 지나치게 강한 열처리를 하거나, 알코올로 너무 오래 탈색하거나, 세척을 너무 강하게 하면 그람 양성균도 CV-1 복합체를 상실해 그람 음성균처럼 보일 수 있다.

②     24시간 이상 배양하게 되면 old culture(정상적으로 실험할 때 쓰는 세균은 18시간 정도 배양한 것을 사용한다.)가 되어 세균이 약해져 있기 때문에 그람 양성균이 음성균처럼 염색 될 수도 있다.

③     그람 양성균에도 CV-1 복합체를 세포 내에 가두는 능력에 차이가 있어 쉽게 잃어버리는 그람 양성균은 음성균처럼 염색될 수 있다.

이 것은 저희 교수님 자료를 바탕으로 제가 다시 구성한 것이기 때문에 자료를 쓰실 때에는 어디에 쓰실 것인지 댓글 정도는 달아 주시면 감사하겠습니다^^